Индукция дифференцировки фибробластов в миофибробласты при изменении соотношения цитоплазматических актинов

Обложка

Цитировать

Полный текст

Открытый доступ Открытый доступ
Доступ закрыт Доступ предоставлен
Доступ закрыт Доступ платный или только для подписчиков

Аннотация

Миофибробласты, играющие важную роль в опухолевом микроокружении, представляют многообещающее направление исследований в области онкотерапии. В данной работе изучали возможности индуцируемой дифференцировки фибробластов человека в миофибробласты путём редукции γ-цитоплазматического актина (γ-А) методом РНК-интерференции. Снижение экспрессии γ-А в подкожных фибробластах человека приводит к позитивной регуляции маркеров миофибробластов, включая α-гладкомышечный актин (α-ГМА), экстра-домен A фибронектина (ED-A FN) и коллаген III типа. Эти изменения сопровождались модуляциями клеточной морфологии, такими как значительное увеличение площади клеток и формирование суперзрелых фокальных контактов. Снижение экспрессии γ-А компенсировалось повышением экспрессии β-цитоплазматического актина (β-А) и α-ГМА, а также формированием характерных α-ГМА-позитивных стресс-фибрилл. В заключение, наши результаты показали, что редукция экспрессии γ-А приводит к миофибробластной транс-дифференцировке подкожных фибробластов человека.

Полный текст

Доступ закрыт

Об авторах

Ю. Г. Левушкина

Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова; Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова

Email: pbkopnin@mail.ru

НИИ физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского, биологический факультет

Россия, 119992 Москва; 119991 Москва

В. Б. Дугина

Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова; Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова

Email: pbkopnin@mail.ru

НИИ физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского, биологический факультет

Россия, 119992 Москва; 119991 Москва

Г. С. Шагиева

Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова

Email: pbkopnin@mail.ru

НИИ физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского

Россия, 119992 Москва

С. В. Бойчук

Казанский государственный медицинский университет; Российская медицинская академия непрерывного профессионального образования

Email: pbkopnin@mail.ru

кафедра общей патологии, кафедра радиотерапии и радиологии

Россия, 420012 Казань; 119454 Москва

И. И. Еремин

ФГБНУ «РНЦХ имени академика Б.В. Петровского»

Email: pbkopnin@mail.ru
Россия, 119991 Москва

Н. В. Хромова

ФГБУ «НМИЦ онкологии имени Н.Н. Блохина» Минздрава России

Email: pbkopnin@mail.ru

НИИ канцерогенеза

Россия, 115478 Москва

П. Б. Копнин

ФГБУ «НМИЦ онкологии имени Н.Н. Блохина» Минздрава России

Автор, ответственный за переписку.
Email: pbkopnin@mail.ru

НИИ канцерогенеза

Россия, 115478 Москва

Список литературы

  1. Patrinostro, X., O’Rourke, A. R., Chamberlain, C. M., Moriarity, B. S., Perrin, B. J., and Ervasti, J. M. (2017) Relative importance of βcyto-and γcyto-actin in primary mouse embryonic fibroblasts, Mol. Biol. Cell, 28, 771-782, https://doi.org/10.1091/mbc.E16-07-0503.
  2. Dugina, V., Zwaenepoel, I., Gabbiani, G., Clément, S., and Chaponnier, C. (2009) β-and γ-cytoplasmic actins display distinct distribution and functional diversity, J. Cell Sci., 122, 2980-2988, https://doi.org/10.1242/jcs.041970.
  3. Simiczyjew, A., Pietraszek-Gremplewicz, K., Mazur, A. J., and Nowak, D. (2017) Are non-muscle actin isoforms functionally equivalent, Histol. Histopathol., 32, 1125-1139, https://doi.org/10.14670/HH-11-896.
  4. Bunnell, T. M., Burbach, B. J., Shimizu, Y., and Ervasti, J. M. (2011) β-Actin specifically controls cell growth, migration, and the G-actin pool, Mol. Biol. Cell, 22, 4047-4058, https://doi.org/10.1091/mbc.E11-06-0582.
  5. Hinz, B., Dugina, V., Ballestrem, C., Wehrle-Haller, B., and Chaponnier, C. (2003) α-Smooth muscle actin is crucial for focal adhesion maturation in myofibroblasts, Mol. Biol. Cell, 14, 2508-2519, https://doi.org/10.1091/mbc.e02-11-0729.
  6. Otranto, M., Sarrazy, V., Bonté, F., Hinz, B., Gabbiani, G., and Desmouliere, A. (2012) The role of the myofibroblast in tumor stroma remodeling, Cell Adhes. Migrat., 6, 203-219, https://doi.org/10.4161/cam.20377.
  7. Tripathi, M., Billet, S., and Bhowmick, N. A. (2012) Understanding the role of stromal fibroblasts in cancer progression, Cell Adhes. Migrat., 6, 231-235, https://doi.org/10.4161/cam.20419.
  8. Gabbiani, G. (2003) The myofibroblast in wound healing and fibrocontractive diseases, J. Pathol., 200, 500-503, https://doi.org/10.1002/path.1427.
  9. Aujla, P. K., and Kassiri, Z. (2021) Diverse origins and activation of fibroblasts in cardiac fibrosis, Cell. Signall., 78, 109869, https://doi.org/10.1016/j.cellsig.2020.109869.
  10. Arnoldi, R., Chaponnier, C., Gabbiani, G., and Hinz, B. (2012) Chapter 88 – Heterogeneity of smooth muscle, In Muscle (Hill, J. A., and Olson, E. N., eds) Academic Press, 2, 1183-1195, https://doi.org/10.1016/B978-0-12-381510-1.00088-0.
  11. Younesi, F. S., Son, D. O., Firmino, J., and Hinz, B. (2021) Myofibroblast markers and microscopy detection methods in cell culture and histology, Methods Mol. Biol., 2299, 17-47, https://doi.org/10.1007/978-1-0716-1382-5_3.
  12. Dugina, V., Khromova, N., Rybko, V., Blizniukov, O., Shagieva, G., Chaponnier, C., Kopnin, B., and Kopnin, P. (2015) Tumor promotion by γ and suppression by β non-muscle actin isoforms, Oncotarget, 6, 14556-14571, https://doi.org/10.18632/oncotarget.3989.
  13. Dugina, V., Shagieva, G., Khromova, N., and Kopnin, P. (2018) Divergent impact of actin isoforms on cell cycle regulation, Cell Cycle, 17, 2610-2621, https://doi.org/10.1080/15384101.2018.1553337.
  14. Ampe, C., and Van Troys, M. (2017) Mammalian actins: isoform-specific functions and diseases, Handb. Exp. Pharmacol., 235, 1-37, https://doi.org/10.1007/164_2016_43.
  15. Arora, A. S., Huang, H. L., Singh, R., Narui, Y., Suchenko, A., Hatano, T., Heissler, S. M., Balasubramanian, M. K., and Chinthalapudi, K. (2023) Structural insights into actin isoforms, Elife, 12, e82015, https://doi.org/10.7554/eLife.82015.
  16. Heissler, S. M., and Chinthalapudi, K. (2024) Structural and functional mechanisms of actin isoforms, FEBS J., 81, 263, doi: 10.1111/febs.17153.
  17. Bergeron, S. E., Zhu, M., Thiem, S. M., Friderici, K. H., and Rubenstein, P. A. (2010) Ion-dependent polymerization differences between mammalian β- and γ-nonmuscle actin isoforms, J. Biol. Chem., 285, 16087-16095, https://doi.org/10.1074/jbc.M110.110130.
  18. Hinz, B., Phan, S. H., Thannickal, V. J., Galli, A., Bochaton-Piallat, M. L., and Gabbiani, G. (2007) The myofibroblast: one function, multiple origins, Am. J. Pathol., 170, 1807-1816, https://doi.org/10.2353/ajpath.2007.070112.
  19. D’Ardenne, A. J., Burns, J., Sykes, B. C., and Kirkpatrick, P. (1983) Comparative distribution of fibronectin and type III collagen in normal human tissues, J. Pathol., 141, 55-69, https://doi.org/10.1002/path.1711410107.
  20. Muro, A. F., Moretti, F. A., Moore, B. B., Yan, M., Atrasz, R. G., Wilke, C. A., Flaherty, K. R., Martinez, F. J., Tsui, J. L., Sheppard, D., Baralle, F. E., Toews, G. B., and White, E. S. (2008) An essential role for fibronectin extra type III domain A in pulmonary fibrosis, Am. J. Respir. Crit. Care Med., 177, 638-645, https://doi.org/10.1164/rccm.200708-1291OC.
  21. Tai, Y., Woods, E. L., Dally, J., Kong, D., Steadman, R., Moseley, R., and Midgley, A. C. (2021) Myofibroblasts: function, formation, and scope of molecular therapies for skin fibrosis, Biomolecules, 11, 1095, https://doi.org/10.3390/biom11081095.
  22. Ragoowansi, R., Khan, U., Brown, R. A., and McGrouther, D. A. (2003) Differences in morphology, cytoskeletal architecture and protease production between zone II tendon and synovial fibroblasts in vitro, J. Hand Surg., 28, 465-470, https://doi.org/10.1016/s0266-7681(03)00140-2.
  23. Dugina, V., Alexandrova, A., Chaponnier, C., Vasiliev, J., and Gabbiani, G. (1998) Rat fibroblasts cultured from various organs exhibit differences in α-smooth muscle actin expression, cytoskeletal pattern, and adhesive structure organization, Exp. Cell Res., 238, 481-490, https://doi.org/10.1006/excr.1997.3868.
  24. Goffin, J. M., Pittet, P., Csucs, G., Lussi, J. W., Meister, J. J., and Hinz, B. (2006) Focal adhesion size controls tension-dependent recruitment of α-smooth muscle actin to stress fibers, J. Cell Biol., 172, 259-268, https://doi.org/10.1083/jcb.200506179.
  25. Younesi, F. S., and Hinz, B. (2024) The myofibroblast fate of therapeutic mesenchymal stromal cells: regeneration, repair, or despair? Int. J. Mol. Sci., 25, 8712, https://doi.org/10.3390/ijms25168712.
  26. Shum, M. S., Pasquier, E., Po’uha, S. T., O’Neill, G. M., Chaponnier, C., Gunning, P. W., and Kavallaris, M. (2011) γ-Actin regulates cell migration and modulates the ROCK signaling pathway, FASEB J., 25, 4423-4433, https://doi.org/10.1096/fj.11-185447.
  27. Lechuga, S., Baranwal, S., Li, C., Naydenov, N. G., Kuemmerle, J. F., Dugina, V., Chaponnier, C., and Ivanov, A. I. (2014) Loss of γ-cytoplasmic actin triggers myofibroblast transition of human epithelial cells, Mol. Biol. Cell, 25, 3133-3146, https://doi.org/10.1091/mbc.E14-03-0815.

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рис. 1. Характеристика культур фибробластов при индукции дифференцировки. Культуры подкожных фибробластов (а) и фибробластов пульпы зуба (б), 5 сут. и 9 сут. после инфекции лентивирусными конструкциями, иммунофлуоресцентное (ИФ)-окрашивание на α-ГМА (зелёный) и γ-А (красный). Масштаб 50 мкм. в – Интенсивность ИФ α-ГМА в α-ГМА-позитивных клетках в подкожных фибробластах (слева) и фибробластах пульпы зуба (справа). На диаграммах представлены значения: среднее ± стандартная ошибка среднего. г – Количество α-ГМА-позитивных клеток в культурах подкожных фибробластов в контроле и при снижении экспрессии γ-А, 5 сут. и 9 сут. после инфекции. Диаграммы представляют значения: среднее ± стандартная ошибка среднего, среднее подсчитано на основании минимум трёх независимых экспериментов, проанализировано не менее 100 клеток в каждом эксперименте. Для статистического анализа результатов применён U-тест Манна–Уитни для всех сравнений. Звёздочки показывают значения p < 0,01 (**) для всех панелей

Скачать (431KB)
Метаданные
3. Рис. 2. Анализ изменения соотношения изоформ актина. а – ИФ-окрашивание γ-А, β-А и α-ГМА в подкожных фибробластах человека через 9 сут. после инфекции мшРНК, масштаб 25 мкм. б – Интенсивность флуоресценции γ-А, β-А и α-ГМА в подкожных фибробластах через 9 сут. после инфекции. Диаграммы представляют среднее ± стандартная ошибка среднего. в – Данные РНК-профилирования, представленные в относительных единицах для подкожных фибробластов человека на 9 сут. РНК-интерференции. ACTA2 – ген α-ГМА, ACTB – ген β-А, ACTG1 – ген γ-А. г, д – Иммуноблот-анализ изоформ актина в подкожных фибробластах человека при уменьшении экспрессии γ-А. Диаграммы представляют соответствующие уровни изоформ актина (среднее ± стандартная ошибка среднего), среднее подсчитано на основании минимум трёх независимых экспериментов, проанализировано не менее 100 клеток в каждом эксперименте. Для статистического анализа результатов применён U-тест Манна–Уитни для всех сравнений. Звёздочки показывают значения p < 0,01 (**), p < 0,001 (***) для всех панелей

Скачать (423KB)
Метаданные
4. Рис. 3. Повышение экспрессии миофибробластных маркеров в подкожных фибробластах человека после снижения экспрессии γ-А. а – ИФ-окрашивание ED-A FN (красный, масштаб 50 мкм) и коллагена III типа (зелёный, масштаб 25 мкм), контроль по сравнению с мшРНК к γ-А (9 сут. после инфекции). б – Интенсивность флуоресценции окраски ED-A FN и коллагена III типа (9 сут. после инфекции), показано в относительных единицах. Диаграммы представляют среднее ± стандартная ошибка среднего. в – Изменение площади проекции клеток на субстрат (в мкм2) для фибробластов в контроле и после снижения экспрессии γ-А (5 сут. после инфекции). г – Формирование стресс-фибрилл на 5 сут. снижения экспрессии γ-А. ИФ-окрашивание α-ГМА (зелёный), DAPI-окрашивание (синий) использовано для выявления ДНК (ядра). Масштаб 25 мкм. д – Формирование околоядерной актиновой сети в миофибробластах на 5 сут. снижения экспрессии γ-А. ИФ-окрашивание α-ГМА (зелёный), γ-А (красный), DAPI (синий, ДНК). Масштаб 25 мкм. Для статистического анализа результатов применён U-тест Манна–Уитни для всех сравнений. Звёздочки показывают значения p < 0,01 (**) для всех панелей. Среднее подсчитано на основании минимум трёх независимых экспериментов, проанализировано не менее 100 клеток в каждом эксперименте

Скачать (363KB)
Метаданные
5. Рис. 4. Созревание фокальных адгезий (ФА) при дифференцировке. a – ИФ-окрашивание паксиллина в подкожных фибробластах человека через 9 сут. после инфекции в контрольных клетках и в клетках со сниженной экспрессией γ-А. Масштаб 10 мкм. б – Динамика созревания ФА на 5 и 9 сут. после инфекции лентивирусными конструкциями. в – Гистограммы распределения ФА различной площади, 5 и 9 сут. после инфекции, контроль по сравнению с клетками со сниженной экспрессией γ-А. Были измерены ФА не менее 30 клеток на эксперимент, данные по трём независимым экспериментам

Скачать (297KB)
Метаданные
6. Рис. 5. Схема показывает особенности дифференцировки фибробластов в миофибробласты, индуцированной уменьшением экспрессии γ-А

Скачать (102KB)
Метаданные

© Российская академия наук, 2025