Разработка мультиплексной ОТ-ПЦР в режиме реального времени для определения уровня экспрессии генов Тoll-подобных рецепторов

Обложка

Цитировать

Полный текст

Открытый доступ Открытый доступ
Доступ закрыт Доступ предоставлен
Доступ закрыт Только для подписчиков

Аннотация

Анализу экспрессии генов иммунного ответа отводится важная роль в изучении взаимодействий организма-хозяина и инфекционного агента. Существует много подходов к проведению такого анализа, однако проблемой остается выбор единого стандарта для нормализации данных. В настоящей работе разработана основанная на мультиплексной ОТ-ПЦР в режиме реального времени система анализа экспрессии генов HPRT1, SDHA, GAPDH и TBP, отобранных в качестве потенциальных референсных генов. С использованием алгоритмов geNorm и BestKeeper на основе экспрессии двух генов — HPRT1 и SDHA сформирован стабильный индекс, который применили при расчете нормализации уровня экспрессии генов Тоll-подобных рецепторов: TLR1, TLR2, TLR4, TLR6 и TLR8. Значения экспрессии генов Тоll-подобных рецепторов в выборке условно здоровых лиц характеризовались высокой стабильностью и положительной взаимной корреляцией (за исключением TLR6), что может указывать на общие механизмы регуляции экспрессии этих генов и подтверждает возможность использования разработанной мультиплексной системы для анализа экспрессии генов иммунного ответа.

Полный текст

Доступ закрыт

Об авторах

С. А. Саламайкина

Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека; Московский физико-технический институт (национальный исследовательский университет)

Автор, ответственный за переписку.
Email: salamaykina@cmd.su
Россия, Москва; Долгопрудный, Московская обл.

В. И. Корчагин

Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Email: salamaykina@cmd.su
Россия, Москва

К. О. Миронов

Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Email: salamaykina@cmd.su
Россия, Москва

Список литературы

  1. Jin M.S., Kim S.E., Heo J.Y., Lee M.E., Kim H.M., Paik S.-G., Lee J.-O. (2007) Crystal structure of the TLR1-TLR2 heterodimer induced by binding of a triacylated lipopeptide. Cell. 130(6), 1071–1082.
  2. Takeuchi O., Hoshino K., Kawai T., Sanjo H., Takada H., Ogawa T., Akira S. (1999) Differential roles of TLR2 and TLR4 in recognition of gram-negative and gram-positive bacterial cell wall components. Immunity. 11(4), 443–451.
  3. Саламайкина С.A., Миронов K.O. (2023) Однонуклеотидные полиморфизмы генов Толл-подобных рецепторов, ассоциированные с риском развития туберкулеза и другими заболеваниями нижних дыхательных путей. Эпидемиология и инфекционные болезни. Актуальные вопросы. 4, 57–61.
  4. Zielniok K., Burdzinska A., Murcia Pienkowski V., Koppolu A., Rydzanicz M., Zagozdzon R., Paczek L. (2021) Gene expression profile of human mesenchymal stromal cells exposed to hypoxic and pseudohypoxic preconditioning-an analysis by RNA sequencing. Int. J. Mol. Sci. 22(15), 8160.
  5. Bednarczyk M., Muc-Wierzgoń M., Walkiewicz K., Kokot T., Fatyga E., Mazurek U. (2017) Profile of gene expression of TLR-signaling pathways in colorectal cancer tissues. Int. J. Immunopathol. Pharmacol. 30(3), 322–326.
  6. Bliss T.W., Dohms J.E., Emara M.G., Keeler C.L. (2005) Gene expression profiling of avian macrophage activation. Vet. Immunol. Immunopathol. 105(3–4), 289–299.
  7. Otto E., Köhli P., Appelt J., Menzel S., Fuchs M., Bahn A., Jahn D. (2020) Validation of reference genes for expression analysis in a murine trauma model combining traumatic brain injury and femoral fracture. Sci. Rep. 10(1), 15057.
  8. Herath S., Dai H., Erlich J., Au A.Y., Taylor K., Succar L., Endre Z.H. (2020) Selection and validation of reference genes for normalisation of gene expression in ischaemic and toxicological studies in kidney disease. PLoS One. 15(5), e0233109.
  9. Ostheim P., Alemu S.W., Tichý A., Sirak I., Davidkova M., Stastna M.M., Abend M. (2022) Examining potential confounding factors in gene expression analysis of human saliva and identifying potential housekeeping genes. Sci. Rep. 12(1), 2312.
  10. Аксельрод Э.В., Миронов K.O., Дунаева E.A., Шипулин Г.A. (2016) Сравнение трех молекулярно-генетических методик для определения основных мутаций в гене HFE, связанных с развитием наследственного гемохроматоза. Клиническая лабораторная диагностика. 61(5), 316–320.
  11. Ye J., Coulouris G., Zaretskaya I., Cutcutache I., Rozen S., Madden T.L. (2012) Primer-BLAST: A tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction. BMC Bioinformatics. 13(1), 134.
  12. Wickham H. (2009) Ggplot2: elegant graphics for data analysis. New York: Springer.
  13. Vandesompele J., De Preter K., Pattyn F., Poppe B., Van Roy N., De Paepe A., Speleman F. (2002) Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes. Genome Biol. 3(7), research0034.1.
  14. Pfaffl M.W., Tichopad A., Prgomet C., Neuvians T.P. (2004) Determination of stable housekeeping genes, differentially regulated target genes and sample integrity: BestKeeper — excel-based tool using pair-wise correlations. Biotechnol. Lett. 26(6), 509–515.
  15. Huggett J., Dheda K., Bustin S., Zumla A. (2005) Real-time RT-PCR normalisation; strategies and considerations. Genes Immunity. 6(4), 279–284.
  16. Bustin S.A., Benes V., Garson J.A., Hellemans J., Huggett J., Kubista M., Wittwer C.T. (2009) The MIQE Guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin. Chem. 55(4), 611–622.
  17. Thomas K.C., Zheng X.F., Garces Suarez F., Raftery J.M., Quinlan K.G.R., Yang N., Houweling P.J. (2014) Evidence based selection of commonly used RT-qPCR reference genes for the analysis of mouse skeletal muscle. PLoS- L One. 9(2), e88653.
  18. Dheda K., Huggett J.F., Bustin S.A., Johnson M.A., Rook G., Zumla A. (2004) Validation of housekeeping genes for normalizing RNA expression in real-time PCR. BioTechniques. 37(1), 112–119.
  19. Lyng M.B., Laenkholm A.-V., Pallisgaard N., Ditzel H.J. (2008) Identification of genes for normalization of real-time RT-PCR data in breast carcinomas. BMC Cancer. 8, 20.
  20. Suzuki T., Higgins P.J., Crawford D.R. (2000) Control selection for RNA quantitation. BioTechniques. 29(2), 332–337.
  21. Fu Y., Yang J., Fan S., Zhao S., Du R., Shah S.M.A., Yang Y. (2020) Selection and validation of optimal endogenous reference genes for analysis of quantitative PCR in four tissues pathologically associated with Kidney-yang deficiency syndrome following influenza A infection. Exp. Ther. Med. 20(6), 244.
  22. Ohl F., Jung M., Radonić A., Sachs M., Loening S.A., Jung K. (2006) Identification and validation of suitable endogenous reference genes for gene expression studies of human bladder cancer. J. Urol. 175(5), 1915–1920.
  23. Song R., He S., Wu Y., Chen W., Song J., Zhu Y., Tan S. (2023) Validation of reference genes for the normalization of the RT-qPCR in peripheral blood mononuclear cells of septic patients. Heliyon. 9(4), e15269.
  24. Huazhang A., Yizhi Y., Minghui Zh., Hongmei X., Runzi Q., Xiaoyi Y., Shuxun L., Wenya W., Zhenghong G., Jun G., Zhihai Q., Xuetao C. (2002) Involvement of ERK, p38 and NF-κB signal transduction in regulation of TLR2, TLR4 and TLR9 gene expression induced by lipopolysaccharide in mouse dendritic cells. Immunology. 106, 38‒45.
  25. Sidletskaya K., Vitkina T., Denisenko Y. (2020) The role of Toll-like receptors 2 and 4 in the pathogenesis of chronic obstructive pulmonary disease. Int. J. Chron. Obstruct. Pulmon. Dis. 15, 1481–1493.
  26. Tian Y., Huang B., Li J., Tian X., Zeng X. (2022) Identification of the association between Toll-like receptors and T-cell activation in Takayasu’s arteritis. Front. Immunol. 12, 792901.
  27. Lu C.-C., Kuo H.-C., Wang F.-S., Jou M.-H., Lee K.-C., Chuang J.-H. (2015) Upregulation of TLRs and IL-6 as a marker in human colorectal cancer. Int. J. Mol. Sci. 16(1), 159–177.
  28. Junjie Mastera Y., Haihua Masterb H., Chaoqun Masterc Y., Maofen Masterd J., Dongxiao Mastera D. (2023) Identification of TLRs as potential prognostic biomarkers for lung adenocarcinoma. Medicine. 102(38), e34954.
  29. Shi S., Xu C., Fang X., Zhang Y., Li H., Wen W., Yang G. (2020) Expression profile of Toll-like receptors in human breast cancer. Mol. Med. Rep. 21, 786–794.
  30. Xiong Z., Bingqian G., Qiang L., Mo Zengnan M. (2022) Toll-Like receptors serve as biomarkers for early diagnosis and prognosis assessment of kidney renal clear cell carcinoma by influencing the immune microenvironment: comprehensive bioinformatics analysis combined with experimental validation. Front. Mol. Bioscie. 9, 832238.

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рис. 1. Схема расположения олигонуклеотидов для детекции целевых участков и определения уровня экспрессии генов. а — Отжиг одного из праймеров в двух экзонах; б — размер фрагмента превышает возможную процессивность используемой Taq-полимеразы; I — последовательность ДНК; II — последовательность кДНК.

Скачать (642KB)
Метаданные
3. Рис. 2. Схема экспериментов для определения уровня экспрессии в двух мультиплексах.

Скачать (675KB)
Метаданные
4. Рис. 3. Распределение значений GM [Ct] генов домашнего хозяйства.

Скачать (185KB)
Метаданные
5. Рис. 4. Диаграмма попарных корреляций значений GM [Ct] генов домашнего хозяйства. Отмечены статистически незначимые результаты.

Скачать (138KB)
Метаданные
6. Рис. 5. Распределение значений относительной экспрессии (Cq) генов TLR.

Скачать (169KB)
Метаданные
7. Рис. 6. Диаграмма попарных корреляций значений относительной экспрессии (Cq) генов TLR.

Скачать (158KB)
Метаданные

© Российская академия наук, 2025